Fortsetzung ......
ausreichten (siehe Folie 3). Die wenig differenzierten Tumoren (G3 bis G4) machen in
der Regel weniger Schwierigkeiten – vorausgesetzt der Urin ist ausreichend
zellhaltig und die Zellen sind gut erhalten. Diagnostische Schwierigkeiten machen in
der Regel die G1- und z.T. auch die G2-Tumoren. Histologisch sind diese Tumoren
sehr gut bzw. gut differenziert. Die geringfügige Kern- und Zellpolymorphie oder die
nur geringfügig oder gar nicht ausgeprägten zytologischen Malignitätskriterien
lassen sich aus den histologischen Bildern (siehe Folie 4-6) sehr gut ableiten.
Die relativ geringe Sensitivität und - weniger stark – die Spezifität von gut
differenzierten Tumorzellen lassen sich vor allem durch molekulare
Nachweismethoden erhöhen. Da stehen uns seit längerer Zeit die von Herrn
Machtens bereits erwähnten sog. Onkoproteine zur Verfügung. U. a. hatten wir seit
vielen Jahren das Onkoprotein 486p3/12 in der Verlaufskontrolle von
Urothelkarzinomen eingesetzt. In der Zwischenzeit aber haben sich wesentlich
bessere und validere molekularpathologische Methoden etabliert:
So z. B. ist die Fluoreszenz in situ-Typisierung (FISH bzw. Multicolor-Urovysion-
Test) eine Methode, mit deren Hilfe genetische Aberrationen auf verschiedenen
Chromosomen nachgewiesen werden können.
Die Sensitivität des zytologischen Nachweises von Urotheltumoren in Abhängigkeit
von der unterschiedlichen Differenzierung beträgt in den aufgeführten Tabellen für
G1-Tumoren lediglich ca. 50 % (siehe Folie 7). Die Angaben über die Sensitivität der
Urinzytologie schwanken in der Literatur sehr und sind vor allem vom dem
zytologisch tätigen Untersucher geprägt. Mit Zunahme der Entdifferenzierung erhöht
sich naturgemäß die Aussagekraft. G3-Tumoren machen unter den oben genannten
Voraussetzungen diagnostisch in der Regel keine oder wenig Probleme.
Auf der Folie 8 sind die Neuerkrankungen verschiedener maligner Tumoren in
Europa aufgelistet. Das Harnblasenkarzinom ist mit 45100 Neuerkrankungen in
Europa vertreten. In Deutschland (Folie 9) werden jährlich ca. 13000
Neuerkrankungen an Harnblasenkarzinomen diagnostiziert. Damit ist das
Harnblasenkarzinom in Deutschland der fünfthäufigste Tumor.
In der Folie 10 sind die malignen Abkömmlinge des normalen Urothels demonstriert.
Dabei sind zwei Gruppen zu verzeichnen.
Die eine Gruppe besteht aus den oberflächlichen Harnblasenkarzinomen pTaG1/G2.
Diese Tumore besitzen eine genetische Stabilität, zeichnen sich durch eine geringe
Progredienz und geringe Rezidivrate sowie langsames Wachstum aus. Sie
rezidivieren in der Regel als ein pTaG1/G2-Tumor. Wenn überhaupt, gehen max. 5%
in weniger differenzierte und invasive Tumore über.
Die zweite Gruppe besitzt ein von vornhinein größeres Malignitätspotential, ist
schlechter differenziert (G3/G4) und wächst nach einer relativ kurzen Latenz invasiv
Die Ursache für dieses unterschiedliche biologische Verhalten dieser zwei
Tumorgruppen dürfte in einem unterschiedlichen genetischen Hintergrund liegen.
Harnblasenkarzinome sind – wie auch andere Malignome – chromosomale
Erkrankungen (Deregulierung des normalen Zellzyklus; Deregulierung von
Proliferation und Apoptose usw. Siehe Folie 11).
Vor Besprechung der molekularbiologischen Grundlagen des Urovysion-Testes
müssen wir einen „Abstecher“ in die normale Zellbiologie und Zellgenetik
unternehmen, da gewisse Kenntnisse des normalen Zellzyklus Voraussetzungen
dafür sind, genetische Aberrationen zu verstehen.
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Die Regulation des normalen Zellzyklus ist ein multifaktorielles, komplexes und
recht kompliziertes Geschehen :
Der normale Zellzyklus ist auf den Folien 12-17 dargestellt. Der Zellzyklus unterliegt
einem sehr spezialisierten und vielschichtigen „Regelmechanismus“, wobei
zahlreiche aufeinander abgestimmte Interaktionen zwischen Kompartimenten des
Kernes, des Zytoplasmas, der Zellmembran und des extrazellulären Raumes
erforderlich sind.
Der Zellzyklus wird in eine G0-Phase, G1-Phase, S-Phase (Synthesephase), G2-
Phase und M-Phase (Mitosephase) unterteilt. Dieser Zyklus besitzt drei markante
Punkte, an denen jeweils die einzelnen Phasen ineinander übergehen und die
Angriffspunkte der Regulationsmechanismen darstellen. Das sind im einzelnen der
G1/S-Kontrollpunkt, der Restriktionspunkt, der G2/M-Kontrollpunkt und der
Spindelkontrollpunkt.
Dieser seit langem bekannte Zyklus wird von zahlreichen Gliedern (Genen bzw.
Regulatorgenen, Regulatorproteinen, Onkoproteinen usw.) reguliert bzw. beeinflusst.
Die wichtigsten Regulatoren sind die Zykline (D-Zykline, E-Zykline, A-Zykline und
AB-Zykline). Diese jedoch sind wiederum abhängig von übergeordneten
Regulationsmechanismen.
In allen Phasen spielt das sog. Retinoblastom-Gen (RB-Gen) in Verbindung mit
Phosphorylierungen in allen Aktivitätsabschnitten des Zellzyklus eine wesentliche
Rolle.
Die Zykline werden wiederum übergeordnet reguliert durch die Zyklin-dependend-
Kinasen (CDK), die wiederum von den Zyklin-dependend-Kinase-Inhibitors (CDKInhibitors)
bzw. Onkoproteinen p18, p15, p19, p21, p16, p27 usw. beeinflusst
werden. Diese Regulationsmechanismen finden vorwiegend in der G1-Phase des
Zellzyklus statt.
Eine Störung dieser Regulationsmechanismen, z. B. der einzelnen Onkoproteine (z.
B. p14, p16 usw.), kann entweder zu einer Überregulation führen, wenn die
Suppressormechanismen versagen oder zu einer Unterregulation, wenn es zu einer
Aktivitätsanreicherung kommt. Ob diese Störung dann zu einer Reparatur führt, an
der u.a. das Onkoprotein p53 wesentlich beteiligt ist, oder zum ungeregelten Zelltod
(Nekrose), zum geregelten Zelltod (Apoptose) oder zum ungebremsten –autonomen,
tumorösen - Wachstum führt, hängt von dem Ergebnis des
Gesamtregulationsgefüges des Zellzyklus ab.
Im Kontext heißt das, dass genetische Aberrationen auf verschiedenen Ebenen in
der Tumorigenese von Karzinomen eine entscheidende Rolle spielen können.
Beim Harnblasenkarzinom sind dies insbesondere vier Chromosomen beteiligt :
1. Chromosom 3 (insbesondere locus 3q )
2. Chromosom 7 (insbesondere locus 7p )
3. Chromosom 17 ( 17p13 ist der locus für p53 )
4. locus 9p21 (kodiert p14 und p16 und beeinflußt damit Rb )
Die genetischen Aberrationen dieser vom Normalen abweichenden DNA-Sequenzen
lassen sich durch die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, die wir vorhin erwähnten,
sichtbar machen.
Wie sieht dieses nun im einzelnen aus?
Seit Crick und Watson im Jahr 1953 ist uns der spiralenförmige Aufbau von
Chromosomen - die Doppelhelixstruktur der DNA - bekannt. Eine DNA oder
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Desoxyribonucleinsäure setzt sich aus Nukleotiden zusammen, die zu
verschiedenen Sequenzen zusammengefasst werden bzw. die sich in einem
gesetzmäßigen Rhythmus wiederholen. Eine Störung dieser DNA-Sequenzen kann
man insofern sichtbar machen, als man ein Pendant zu diesen DNA-Sequenzen
„andockt“ und diese „andockende“ DNA-Sequenz mit Fluoreszenzfarben markiert.
Wenn man nun die verschiedenen Genaberrationen mit verschiedenen
Fluoreszenzfarbstoffen markiert, bekommt man für jedes einzelne aberrierte Gen ein
unterschiedliches Farbsignal. Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung wurden für
das Chromosom C3 rot, für C7 grün, für C17 blau und für 9p21 gold (gelb) benutzt.
Da jede normale Zelle jeweils über zwei identische Chromosomensätze verfügt, muß
also jede Zelle für jedes Chromosom zwei Signale aufweisen. Das kann man durch
die Multicolorfluoreszenz-in situ-Hybridisierung – kurz durch die FISH – sehr gut
demonstrieren. Kommt es nun zu einer Überamplifikation dieses Gens, ist also das
Gen mehrfach in der Zelle vorhanden, dann haben wir entsprechend mehr Signale
(Amplifikation) als normal. Oder - im Gegenteil – bei weniger als zwei Signalen wird
von einer Deletion gesprochen.
Der FISH-Test weist also nach, ob ein Gen normal exprimiert, amplifiziert oder
deletiert ist.
Diese Veränderungen bilden die Grundlagen für den molekularbiologischen
Nachweis von chromosomalen Veränderungen in den Urothelien und damit auch für
den UroVysion-Test (Folie 18). Auf den Folien 19-25 sind Einzelheiten der FISHTechnik
beschrieben. Durch kurze fluoreszenzmarkierte DNA-Sequenzen werden
komplementäre Abschnitte in bekannten Zielsequenzen gesucht. Somit können
genetische Veränderungen an bestimmten Abschnitten der Gene durch
verschiedene Fluoreszenzfarben (z.B. rot, grün, blau und gold) sichtbar gemacht
werden. Dabei wird das Zentromer des Chromosomen 3 mit einem roten, das
Zentromer des Chromosomen 7 mit einem grünen, das Zentromer des
Chromosomen 17 mit einem blauen und der Locus 9p21 des Chromosomens 9 mit
einem gelben bzw. goldfarbenen Fluoreszenzfarbstoff markiert. Da jedes Gen mit
zwei Allelen in einem normalen Kern enthalten ist, müssen entsprechend auch
normalerweise zwei rote, zwei grüne, zwei gelbe und zwei blaue Signale in einem
Zellkern aufleuchten. Abweichungen von diesem Normalbefund werden als
Zunahme (Amplifikationen /Polyploidien) oder als Verlust (Deletionen) sichtbar
gemacht.
Der kurz gefaßte Arbeitsablauf des Urovysion-Testes geht aus der Folie 24 hervor :
1. Zellen aus dem Urin auf einem Objektträger fixieren
¥ z.B. über Cytospin-Zentrifuge
2. Vorbehandlung und Hybridisierung
¥ Proteaseverdau und Dehydrieren (Alkoholreihe)
¥ DNA-Sondenmix zugeben und inkubieren
¥ DAPI Gegenfärbung
3. Interpretation der Ergebnisse
¥ Auswertung von 25 malignen Zellen
¥ Laut Kriterien gelten z.B. > 5 Zellen mit mehr als einem zusätzlichen
Chromosom als FISH +
In der Folie 25 sind sowohl normale Zellkerne mit einem diploiden
Chromosomensatz der dargestellten Centromere (also jeweils zwei gleichfarbene
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Signale für C3, C7, C17 und für 9p21) auch Tumorzellkerne mit chromosomalen
Aberrationen (in diesen Zellkernen mehr als nur zwei Signale pro Centromer bzw.
Polyploidie oder weniger als zwei Signale,d.h. Deletion) enthalten.
Die Folien 26 und 27 zeigen, wie durch den Urovysion-Test zytologischdifferentialdiagnostisch
schwierige Urinsedimente besser charakterisiert und
diagnostiziert werden können.
Wie bereits in der Folie 10 beschrieben, zeigt die Folie 28 – etwas abstrahiert –
molekularpathologische Befunde bei Oberflächenkarzinomen und invasiven
Karzinomen. In Oberflächenkarzinomen wird zumeist eine Aberration bzw. Deletion
des Locus 9p/21 und in invasiven Karzinomen Aberrationen im Bereich der
Chromosomen 3, 7 und 17 beobachtet. Dieser Sachverhalt ist in den Folien 29 und
30 ausgewiesen.
In den Folien 31 und 32 sind die Zuwächse vor allem der Sensitivität der
Urinzytologie durch den hinzugekommenen FISH-Test (Urovysion-Test) anhand von
drei Studien aufgeschlüsselt. In allen untersuchten Kategorien der verschieden
differenzierten Urothelkarzinome bzw. in jedem Fall erhöht der Urovysion-Test die
Sensitivität der konventionellen Urinzytologie.
Mit dem Urovysion-Test sollen in der Nachsorge von Tumorpatienten/innen frühe
Stadien von Harnblasentumoren (vorwiegend Verlust von Chromosomen 9p21
einerseits und andererseits aggressive Tumore herausgefunden werden, wobei sich
letztere zumeist durch polyploide Veränderungen der untersuchten Genabschnitte
auszeichnen.
In der Folie 34 ist ein Algorhythmus aufgezeichnet, aus dem die Weichenstellung
hervorgeht, die dem Urovysion-Test (sog. Multicolor-Urovysion-Test bzw. FISHTest)
zukommen kann:
Bei Zustand nach Harnblasenkarzinom können mittels des FISH-Testes – etwas
überzeichnet dargestellt – die Befunde bzw. die Tumore in zwei Kategorien eingeteilt
werden. Einerseits in die bereits mehrfach angesprochene Low-risk-Gruppe, die sich
durch eine mehr oder weniger stabile Genetik , guten Differenzierungsgrad,
langsames Tumorwachstum und niedrigere Rezidivrate auszeichnet.
Die andere Gruppe, d.h. die High-risk-Gruppe zeichnet sich durch hochmalignes
Tumorwachstum (pTaG3) und durch das Carcinoma in situ aus, das in der Regel als
TisG3-Tumor diagnostiziert wird. Die Tumoren dieser Gruppe gehen in der Regel
relativ früh in invasives Wachstum und letztlich in muskelinvasive Tumore über.
Diese Tumore zeichnen sich durch eine genetische Instabilität aus.
Zusammenfassung ( Folie 35) :
An der Karzinogenese von Blasentumoren können eine ganze Reihe von Onkogenen
und Tumorsuppressorgenen beteiligt sein. Das Zusammenspiel dieser Faktoren führt
zu Tumorentstehung, Fortschreiten des Tumors und schließlich zur Metastasierung:
1. Chromosomale Aberrationen führen zur Initiation der Karzinogenese
2. Verlust der Zellzyklusregulation führt zur Zell- bzw.Tumorproliferation
3. Verlust der Zelladhäsion führt zur Metastasierung
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Zu den Onkogenen, die am Blasenkarzinom beteiligt sind, zählen u. a. das cH-ras,
c-myc und zahlreiche Regulatorgene der Gruppe der Cycline, der Cyclin-Inhibitoren
und deren übergeordete Regulatorgene. Das Gen 13q14 – auch Retinoblastom
genannt – spielt in fast allen Phasen des Zellzyklus und der Tumorigenese eine
Schlüsselrolle.
In vorausgegangenen Studien (u.a. Bubendorf et al 2001) ließen sich mit Hilfe des
Urovysion-Testes dreimal mehr pTa-Tumoren - verglichen mit der Zytologie -
nachweisen. Im Vergleich der Sensitivitäten von Blasenspülflüssigkeiten und
Urinzytologien (Spontanurin) erwiesen sich die Blasenspülflüssigkeiten als sensitiver.
Es konnte eine Steigerung der Sensitivität für alle invasiven Tumoren (pT1-4) auf 100
% festgestellt werden, während die konventionelle Zytologie nur ca. 2/3 dieser
Tumore erfasste. Hier ist der FISH-Test der Zytologie weit überlegen, da in der
reinen Zytologie von Urin- oder Blasenspülflüssigkeiten reaktive urotheliale
Veränderungen sehr oft nicht von gut differenzierten neoplastischen Urothelien
abgegrenzt werden können.
Bei Patienten mit negativen Nachsorgezytologien, die jedoch in dem FISH-Test
positiv reagierten, konnte ein Tumorrezidiv wahrscheinlich gemacht werden, das in
der Regel frühestens ca. nach sechs bis neun Monaten entstehen kann.
Demgegenüber ist in Nachsorgezytologien von FISH-negativen Fällen auch noch
nach sechzehn bis neunzehn Monaten kein Rezidiv aufgetreten.
Mit Hilfe des Urovysion-Testes können Hinweise auf „low grade“ und „high grade“-
Tumoren insofern gezogen werden, als ein Verlust von 9p21 ohne weitere
Polyploidie für ein low grade-papilläres Karzinom (pTaG1/G2) spricht, während die
Vermehrung von CEP3, 7 und 17 eher auf die „high grade-Tumoren“ (pT1-4)
hinweist.
Facit für die Klinik:
In der Nachsorge von Harnblasentumoren bei negativer Zytologie entscheidet
der FISH-Test über das weitere Procedere:
FISH-negative Kontrollen werden in die low risk-Gruppe mit längeren
Zystoskopien-Intervallen eingruppiert.
FISH-positive Fälle werden als high risk-Gruppe eingeordnet und kürzerfristig
zystoskopiert.
Vor allem die relativ geringe Sensitivität und Spezifität der zytologischen Diagnostik von
Harnblasenkarzinomen lässt sich durch die oben genannte Methode der molekularen
Nachweismethode (UroVysion) deutlich erhöhen.
Anmerkung (Folie 36 – 37) :
Den Mitarbeiterinnen der Firma Abbott – insbesondere den Damen Frau Dr.med. Dipl.
biochem. Patricia Geller und Frau Spauke danke ich sehr für die freundliche Überlassung
der Vorlagen zu den Folien 7 - 10, 18 – 23, 25 – 27, 29 – 33 und zu der Folie 35. Frau
Dr.med.vet. Katrin Henneicke danke ich sehr für die molekularpathologischen
Untersuchungen, ihre Hilfsbereitschaft, vertrauensvolle Zusammenarbeit und
uneingeschränkte Kooperation (s.auch Folie 36 der Präsentation).
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Aus der Urologischen Klinik und Poliklinik
der Ludwig-Maximilians-Universität München
Direktor: Prof. Dr. med. C. Stief
http://edoc.ub.uni-muenchen.de/12679/1/Will_Armin.pdf Untersuchungen zur Fluoreszenz – in – situ –
Hybridisierung (FISH) beim Urothelkarzinom des oberen
Harntrakts
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin
an der Medizinischen Fakultät der
Ludwigs-Maximilians-Universität München
Thema: Information (Gelesen 1221 mal)